Inicjacja transkrypcji u E.coli

[szymon]

Chcialbym z Wami poruszyć problem inicjacji transkrypcji u bakterii E.coli.Wspierając się odpowiednią literaturą np"Biologia molekularna bakterii"mozna w uproszczeniu powiedzieć,że
sposoby kontroli inicjacji transkrypcji u bakterii to
a) kontrola konstytutywna,zależna od wydajności promotora-ta zaś zalezy od jego siły na co się składa :sekwencja w bloku -35 i -10 oraz odleglość między nimi
b) regulacja inicjacji transkrypcji zależna od białek aktywatorowych
Drugim sposobem nie chcialbym sie zajmowac ze wzgledu na jego zlozoność .Do analiz promotorów konstytutywnych dla podjednostki sigma 70 posłuzył mi program :

Kod: Zaznacz cały

linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb

który w tych przypadkach charakteryzuje się wysoką przewidywalnością.
Za przykład niech posłuzy operon rfaQp1.:

Kod: Zaznacz cały

biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=OPERON&object=TU0-7161

Program idealnie przewiduje promotor dając wynik:
Promotor rzeczywisty: LDF- 4.60 -10 box at pos. 46 TGATACACT Score 56 -35 box at pos. 31 TTGCTG Score 47 (analizowałem 200pz od poczatku genu).
zgodny z rzeczywistym promotorem,z ktorego nastepuje start transkrypcji.Wielkość LDL(tutaj 4,60)opisuje zwiazek miedzy blokami -35 i -10 a dlugoscia miedzy nimi.Im wiekszy LDL tym silniejszy ,a scislej wieksze prawdopodobienstwo startu transkrypcji w tym miejscu.Z ciekawości sprawdziłem cały operon-zarowno nic kodujacą ,jak i komplementarną.Wynik okazał się zaskakujacy.Okazało się ,że w operonie są w sumie aż 24 potencjalne promotory o porownywalnym LDL jak rzeczywisty ,z czego kilkanascie wyraznie silniejszych .
Pytanie :w jaki sposób RNAP wybiera ten własciwy promotor ,a pomija inne? Czym się kieruje enzym w odnalezieniu tegosłusznego"skoro zarowno sekwencje jak i odleglosci miedzy nimi prowadziłyby do błędnej inicjacji transkrypcji.
Program ten,jak i ta rekomendowana książka, nie dają na to odpowiedzi,a przeciez jest to fundamentalne zagadnienie w przypadku wiekszosci promotorow konstytutywnych.

[yeast]

Nie znam tego zagadnienia dogłębnie, ale przypuszczam, że to co zwykle w takich wypadkach - masa innych białek, które wiążą sie z innymi sekwencjami występującymi w rejonie właściwego promotora.

[szymon]

Nie znam tego zagadnienia dogłębnie, ale przypuszczam, że to co zwykle w takich wypadkach - masa innych białek, które wiążą sie z innymi sekwencjami występującymi w rejonie właściwego promotora.

Prawdę mówiąc nie jest to odpowiedż na moje pytanie ,ale stwierdzenie faktu.Zreszta on dot.innego problemu-regulacji transkrypcji przez aktywatory,a nie inicjacji transkrypcji przez sigma 70 bez dodatkowych białek.Najpierw wolę znależć odpowiedz na łatwiejszy problem,niz wikłać się w zagadnienia wyboru własciwego TF i zwiazanie z odpowiednim promotorem.
Proszę -przeczytaj uwaznie mój post i spróbuj sie do niego odnieść ,byc może znajdziesz lepsze przykłady.pozdrawiam

[Savok]

Wrecz przeciwnie, to jest odpowiedz na twoje pytanie. Inicjacja trankrypcji nigdy nie zachodzi ot tak sobie sama z siebie. Sekwencja promotorowa to tylko miejsce w ktorym polimeraza ma ulatwione wiazanie sie ze wzgledu na wlasciwosci sekwencji. Transkrypcja bez czynnikow transkrypcyjnych nie zajdzie i rozpatrywanie tego zagadnienia bez uwzglednienia czynnikow trans nie ma najmniejszego sensu.

Po drugie sekwencje promotorowe nie sa tak bezposrednio przypisane do jednostek sigma jakby ci sie chcialo w to wierzyc.

[szymon]

Transkrypcja bez czynnikow transkrypcyjnych nie zajdzie i rozpatrywanie tego zagadnienia bez uwzglednienia czynnikow trans nie ma najmniejszego sensu.

Chodzi mi o konkretne zagadnienie-inicjację transkrypcji z promotorów konstytutywnych przy udziale podjednostki sigma 70,a nie transkrypcję w ogóle.
Nie wiem skąd ta inf.zaczerpnałeś w odniesieniu do tego problemu ,ale wystarczy analiza bazy danych RegulonDb,by stwierdzic,że się mylisz

Wynika dla mnie z niej ,że liczba jednostek transkrypcyjnych wynosi 3359,a liczba miejsc wiazania przez TF(wszystkich)-1652.Oznacza to,że wiekszość operonów do swej aktywnośći nie wymaga żadnych dodatkowych TF.Oczywiscie TF są niezbędne w przypadku pozytywnej kontroli inicjacji transkrypcji np.regulon cAMP-CRP ,a wynika to z tego,ze promotory w blokach -35 i/lub -10 odbiegają od kanonicznej(stąd algorytmy w tych przypadkach dają często błędne wskazania).
Savok pisze:

Po drugie sekwencje promotorowe nie sa tak bezposrednio przypisane do jednostek sigma jakby ci sie chcialo w to wierzyc.

Gdyby tak nie było, inicjacja transkrypcji zachodziłaby w sposób wadliwy.Polecam lekturę np"Biologii."str316,aby stwierdzić,że rzeczona podjednostka sigma 70,jak i alternatywne mają kanoniczne sekwencje promotorowe o wysokiej zachowawczościTo prawda,że stopień zachowawczości promotorów u pozostalych podjednostek jest mniejszy,a u np.sigma 54 konieczny jest aktywator,ale poruszony przeze mnie problem dot tylko promotorów sigma 70.
Proszę Cię ,abys lepiej uzasadnial swoje tezy tzn.podawał dane naukowe ,abym mógł uzupelniać i konfrontować swoją wiedzę o kompetentne żródła.

[Jakusz]

Oznacza to,że wiekszość operonów do swej aktywnośći nie wymaga żadnych dodatkowych TF

Sugerujesz, że przylatuje sobie polimeraza RNA i rozpoczyna transkrypcję BEZ ŻADNYCH TF? A to Ci dopiero teoria.
Oczywiście mówimy o sytuacji in vivo.

[szymon]

Sugerujesz, że przylatuje sobie polimeraza RNA i rozpoczyna transkrypcję BEZ ŻADNYCH TF? A to Ci dopiero teoria.

Ja nie sugeruję tylko stwierdzam fakty na podstawie baz danych np. regulon-polecam się z nią zapoznać oraz z literaturą np."BiologiaO tym też pisze:

zobacz-ten-plik.pdf

(988.98 KiB) Pobrany 16 razy

Inicjacja transkrypcji u wiekszosci operonów konstytutywnych bakterii zależy tylko i wyłącznie od siły promotora-TF są zbędne.
Problem jaki poruszyłem,a ktory odnoszę jak na razie wrażenie ,nie znajduje zrozumienia,dot.umiejetnosci odnalezienia przez polimerazę tego potrzebnego promotora sposrod wielu alternatywnych,czesto równie silnych,a mimo to nieaktywnych transkrypcyjnie.Do dyskusji o tym zachecam ,a nie o kwestionowanie faktów.

[yeast]

Inicjacja transkrypcji u wiekszosci operonów konstytutywnych bakterii zależy tylko i wyłącznie od siły promotora-TF są zbędne.

Bzdura. In vivo zawsze są jakieś czynniki in trans, może nie zostały jeszcze scharakteryzowane. A określanie miejsc wiązania na podstawie tylko sekwencji i to bez odniesienia do miejsc wiązań innych czynników jest dość wątpliwe.

Wynika dla mnie z niej ,że liczba jednostek transkrypcyjnych wynosi 3359,a liczba miejsc wiazania przez TF(wszystkich)-1652.Oznacza to,że wiekszość operonów do swej aktywnośći nie wymaga żadnych dodatkowych TF.

To oznacza tylko, że nie znaleziono eksperymentalnie lub nie przewidziano miejsc wiązania TF. Nie więcej nie mniej.

[szymon]

Bzdura. In vivo zawsze są jakieś czynniki in trans, może nie zostały jeszcze scharakteryzowane. A określanie miejsc wiązania na podstawie tylko sekwencji i to bez odniesienia do miejsc wiązań innych czynników jest dość wątpliwe.

Swoją wiedzę o tym,jakiej regulacji podlegają geny Ecoli(konstytutywne) czerpię z badań empirycznych-najnowszych i czołowych baz danych,a do takiej mozna zaliczyć RegulonDb.Piszesz Yeast,że zawsze są jakieś czynniki trans,ale na jakiej podstawie?Czy znasz prawo(model) ,ktore by to tak opisywało?Prawdopodobnie ekstrapolujesz badania nad eukariota i przenosisz je na bakterie.Tam chyba rzeczywiscie geny ,ktore nie maja TF są wyjatkiem,ale u E.coli -jak widac nie.Oczywiscie jest mozliwe,że nie zostaly scharakteryzowane,ale mozna tak odpowiedzieć rowniez w odniesieniu do kazdego problemu np. sigma unknown-może jest wiele alternatywnych podjednostek sigma ,a nie tylko kilka.Tym bardziej,że sa bakterie,ktore posiadaja ich wiele.Dzisiejszy stan wiedzy nie uprawnia do stwierdzenia,że kazdy promotor e.coli musi miec dodatkowy TF-wystarcza specyficzność promotora i odpowiedniej podjednostki-sigma 70.Zauważ ,że dysproporcja jest uderzająca w stosunku do liczby promotorów a liczby miejs wiazania przez TF-zupelnie inaczej niz u np.Saccharomyces .
Przeszukujac(losowo) bazę YEASTRACT (Yeast Search for Transcriptional Regulators And Consensus Tracking):

Kod: Zaznacz cały

yeastract.com/tutorial.php

stwierdzam,że nie znalazlem genu,ktory by nie podlegał regulacji przez TF,a często są to 4-5 TFPodobne przeszukanie bazy RegulonDb daje mi zupelnie odmienny wynik w odniesieniu do np.sigma 70-bez trudu znajduję setki(!)genów nie podlegajacych zadnej regulacji przez TF.Podobne wyniki dają inne bazy prokariota np.CoryneRegNet :

Kod: Zaznacz cały

coryneregnet.de/

Ciekawa jest statystyka dla TF u E.coli.
Wynika z niej,że w sumie 1210 genów podlega regulacji przez TF sposród 4305 -zgadnij jaki to jest procent?Wiekszość z nich wymaga tylko 2 TF do regulacji.W odniesieniu do problemu,ktory ja poruszylem liczba TF jest jeszcze mniejsza ,bo dot.tylko inicjacji i tylko genów konstytutywnych.Tyle wiemy na dzisiaj w odniesieniu do podobnie sumiennie badanych organizmów modelowych-dysproporcje są uderzajace i musza dawać do myslenia.Raczej nic nie wskazuje ,by ta przepaść zostać miała zasypana jakimis nowymi TF i to w odniesieniu do calego genomu.Liczba nowych miejsc TF oczywiscie bedzie rosła u E.coli,ale rosnie rowniez liczba promotorów-wydaje się dzisiaj,ze nie widac przełomu w wyjasnieniu tego zagadnienia czytając statystykę regulon z ostatniego roku.
Zresztą wykrycie TF przed jakimś promotorem tylko komplikuje wyjasnienie mechanizmu inicjacji transkrypcji a)komorka musi wiedzieć jaki TF i b) w ktorym miejscu umieścić,ale to temat na oddzielną dyskusję,moze potrafisz to zagadnienie wytlumaczyć,bo dla mnie jest ono jeszcze bardziej zawiłe.

[yeast]

Mam propozycję - przeprowadź eksperyment wiązania się in vitro sekwencji promotorów z sigmą70 oraz rekonstutucji transkrypcji in vitro bez dodatkowych czynników oraz w obecności dajmy na to lizatu z E. coli. I porównaj wyniki. Wtedy będziesz wiedział czy dodatkowe TF nie są potrzebne. Bo z tego co wiem nie wszystkie są znane, więc nie możesz wykluczyć ich udziału na podstawie posiadancyh danych.

[Jakusz]

A dodam, że idąc przeczuciem i wnioskując obecnie posiadanej wiedzy, możemy z dużą dozą prawdopodobieństwa stwierdzić, że same sekwencje regulatorowe to za mało by zainicjować transkrypcję. Twoje podejście, jakoby wszystko dało się przewidzieć z sekwencji i na postawie jakiegoś modelu matematycznego jest zdecydowanie nietrafione. Wystarczy porozmawiać z biologami molekularnymi, którzy mają styczność z tego typu programami, aby dowiedzieć, że próby korzystania z algorytmów kończyły się fiaskiem, bo nic nie szło tak jak sobie to przewidział komputer, gdy przychodziło do doświadczeń robionych tradycyjnymi metodami. Ot co - matematyka może opisać ten proces, ale nie przewidzieć efekty, bo biologia nie jest tak przewidywalna, jak się matematykom wydaje.

[szymon]

Mam propozycję - przeprowadź eksperyment wiązania się in vitro sekwencji promotorów z sigmą70 oraz rekonstutucji transkrypcji in vitro bez dodatkowych czynników oraz w obecności dajmy na to lizatu z E. coli. I porównaj wyniki. Wtedy będziesz wiedział czy dodatkowe TF nie są potrzebne.

In vivo nie są potrzebne ,bo tak opisują różne,specjalistyczne bazy danych,a więc przeprowadzono eksperymenty w tej materii,ktore wskazują,że inicjacja transkrypcji zachodzi skutecznie z promotorów konstytutywnych sigma 70(wiekszości,choć nie wszystkich)bez udziału TF.Nie czuję się kompetentny wykonać takie eksperymenty,ale z chęcia poznam jakieś badania naukowe na tym polu-czekam na Twoje propozycje np.linki do odpowiednich czasopism,ktore to analizują(jesli sugerujesz,ze bazy transkrypcyjne e.coli są wysoce niekompletne)Wiadomo,że in vitro jest mozliwe wiecej oddziaływań z promotorem niz in vivo,ale pytanie :dlaczego profesjonalne bazy danych E.coli nie wykrywają tych interakcji TF dla większosci promotorów,a podobne bazy dla drozdzy dają radykalnie odmienne wyniki-liczba promotorów bez TF jest zblizona do zera-skąd te różnice?Naukowcy zajmujacy się E.coli są mniej kompetentni niz zajmujacy się drozdzami?
To o tyle dziwne,że liczba baz danych jest liczna ,to nie tylko regulon:

Kod: Zaznacz cały

uni-giessen.de/ecoli/IECA/index.php

Bo z tego co wiem nie wszystkie są znane, więc nie możesz wykluczyć ich udziału na podstawie posiadancyh danych

Podobnie jest u np.drozdzy,a przecież profil transkrypcyjny od kilku lat pokazuje,ze sa tam obecne liczne TF w praktycznie kazdym promotorze-inaczej niz u e.coli.Mimo,że liczba TF i ich interakcji rosnie ,to nie zostaje zasadniczo zmieniony obraz inicjacji transkrypcji-wymagana jest tylko RNAP dla setek operonów .Uważam ten obraz za wiarygodny w obliczu tak licznych baz danych i tak wielu wzajemnie się potwierdzajacych sie eksperymentów.
Co wiecej-nawet jak stwierdzisz,że in vivo ma miejsce oddzialywanie TF z promotorem np.białka FIS

Kod: Zaznacz cały

biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=ENZYME&object=CPLX0-7705

to wyjaśnij(cie) mi proszę na dowolnym operonie-
a)dlaczego w regulacji jego bierze udział własnie ten czynnikb)dlaczego wiąże sie w tym a nie innym miejscu operonu?
Bez odpowiedzi na te przykładowe problemy,tlumaczenie inicjacji transkrypcji przy pomocy TF tylko komplikuje obraz i piętrzy nowe pytania.Uważam ,ze nalezy upraszczać problemy,a tlumaczenie inic.trans.tylko przy pomocy odp.promotora jest taka próbą,choc jak pokazuje doswiadczenie ma ona tez swoje braki(patrz podany przykład).

[malgosi35]

Przepraszam. A z kim my dyskutujemy. Możesz ujawnić swój wiek i wykształcenie.
Podejrzewam licealistę lub początkującego studenta, który uważa, że zjadł wszystkie rozumy.