Izolacja DNA

[blooza]

Witam, mam pytanie-w jakim celu podczas izolacji DNA z liści spichrzowych cebuli mieszaninę należy trzymac w łaźni parowej ? I po co dodaje się proteazy skoro wcześniej utrzymuje się mieszanine w łaźni lodowej by hamowac działanie enzymów degenerujących DNA?

[AnnaWP]

2) Bo proteazy trawią białka, a nie DNA - jak wynika z nazwy

[blooza]

nie rozumiem zależności.

[helicobacter]

Zamieść pełną metodykę

[helicobacter]

Mam pytanie - najbardziej prymitywna izolacja DNA jaka została użyta i wyszła. Wierzę, że to proste pytanie

[Tahyon]

Słyszałem o akcji jakoby wierzchołki wzrostu w korzeniu poddano miażdżeniu a następnie w buforze przepuszczono przez podłoże krzemionkowe. Podobno coś wyszło ale wiadomo - wartość takiego izolatu jest znikoma:) Na necie są też poradniki jak chałupniczo zrobić izolację i uważam, że przy odrobinie wyobraźni nawet mogą się udać.

[karteczka88]

w tym numerze Wiedza i życie jest podany przykład izolacji dna

[Jakusz]

Mam pytanie - najbardziej prymitywna izolacja DNA jaka została użyta i wyszła. Wierzę, że to proste pytanie

Jeśli dobrze rozumiem, to odpowiedź na Twoje pytanie może znajdować się tutaj: wytracanie-dna-z-cebuli-vt16965.htm

[helicobacter]

Ciekawe. Mimo wszystko kroków i zabawy jest i tak dużo, ale ekonomicznie - bardzo tanie, brawo

Ma ktoś jeszcze jakieś pomysły ?

[Xenesthis]

Odpowiedz na pytanie z pierwszego postu.

Proteinazę K dodaje się aby wytrawiła białka. Nić DNA to nie jest oddzielna część komórki, w wielu miejscach są przyłączone białka które działają np jako aktywatory i inhibitory transkrypcji oraz spełniają wiele innych funkcji nad którymi nie ma sensu się rozpisywać. Te białka muszą zostać usunięte aby nici DNA można było użyć do dalszych eksperymentów. Na przykład, jak wyobrażasz sobie przyłączenie starterów do PCR kiedy w miejscu ich przyłączenia siedzi jakieś białko, takie białko musi zostać wcześniej usunięte i do tego służy proteinaza K.

W łaźni wodnej przetrzymujemy mieszaninę po dodaniu proteinazy K, ponieważ ta proteinaza najlepiej działa w temp 37 stopni C. Nie musi być to łaźnia wodna, wystarczy zwykła cieplarka. Proteinazę i zdegradowane białka wypłukujemy mieszaniną fenol/chloroform, potem mieszaninę chłodzimy w -20 stopniach w 100% ETOH co powoduje wytrącenie DNA z roztworu.

Poniżej zamieszczam skrypt z mojej pracy magisterskiej opisujący jak uzyskać DNA z larwy Drosophila melanogaster

W eppendorfie o objętości 1,5ml roztarto larwy zawieszone w 30 μl buforu A przy pomocy plastikowego tłuczka dostosowanego do eppendorfa.
1. Wirowano 1‟, przy obrotach13000 rpm.
2. Usunięto supernatant, następnie dodano 200μl buforu A.
3. Wirowano 1‟ przy maksymalnych obrotach, następnie usunięto supernatant.
4. Przygotowano mieszaninę buforu B z proteinazą K w następujący sposób:
- Dodano 1μl proteinazy K (20mg/ml) do 100μl buforu B, całość zamieszano.
5. Szczątki larw zawieszono w 36 μl wcześniej przygotowanego buforu B z proteinazą K i dodano 4 μl 10℅ SDS.
6. Wszystko zamieszano za pomocą pipety automatycznej a następnie inkubowano przez godzinę w temperaturze 37 °C.
- 25 -
7. Po inkubacji dodano 9 μl 3M NaCl i dokonano ekstrakcji dodając 30 μl roztworu fenol/chloroform (1:1) i bardzo dokładnie wytrząsając. Następnie zawiesinę zwirowano przez 1‟ przy maksymalnych obrotach.
8. Do nowego sterylnego eppendorfa przeniesiono 49 μl otrzymanego ekstraktu i dodano 150 μl EtOH. Mieszaninę pozostawiono przez noc w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia DNA.
9. Następnego dnia mieszaninę zwirowano przez 5‟ w temperaturze 4oC przy obrotach 13000rpm. Ostrożnie zlano górną warstwę EtOH aby nie utracić osadu zawierającego DNA.
10. Osad wypłukano 200 μl 70℅EtOH i zwirowano jak w punkcie 8
11. Po zlaniu jak największej ilości 70℅ EtOH, osad suszono przez kilka minut w temperaturze 37°C w celu wyparowania resztek etanolu.
12. Wyizolowane DNA zawieszono w 60 μl sterylnej wody.
13. Tak otrzymany DNA użyto do reakcji PCR.