Spotkanie Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych - Relacja V2

Dział dla zaawansowanych - testy aparatów i obiektywów oraz innego sprzętu mikroskopowego, porównania i przeróbki; szczegółowe opinie na temat różnych mikroskopów, aparatów, adapterów; techniki fotografowania; archiwalne instrukcje i materiały producentów; dobry sprzęt na rynku wtórnym - doświadczenia;
JohnyM

Spotkanie Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych - Relacja V2

Post autor: JohnyM »

Dziś minął pierwszy dzień, otwartego (po rejestracji) XI Spotkania Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych w Poznaniu. Byłem pierwszy raz, początkowe wrażenia bardzo pozytywne. Wydarzenie zorganizowane wspólnie przez Zeiss oraz UAM. Uczestnicy to głównie naukowcy, studenci i specjaliści z całego kraju.

Początkowo, w 3-4 osobowych grupach, odbywała się prezentacja sprzętu, wraz z opisem techniki, możliwościami i przeglądem próbek na żywo. Następnie sprzęt był udostępniony uczestnikom na parę godzin, do przeglądania własnych preparatów, całość trwała 7 godzin, jutro dzień drugi. Do dyspozycji było 5 stanowisk:
- Mikroskop odwrócony Axio Observer 7 z modułem konfokalnym LSM 800.
Wygląda i działa identycznie jak poniższy, dlatego odpuszczę opis i zdjęcia.
- Mikroskop odwrócony Axio Observer 7 z modułem konfokalnym LSM 880 z przystawką super-rozdzielczą AiryScan.
AxioObserver7LSM880AiryScan.jpg
Mikroskop jest bardzo duży, do tego dochodzi szafa z laserami i osprzętem o podobnej objętości jak optyka.
AxioObserver7LSM880AiryScan_1.jpg
AxioObserver7LSM880AiryScan_2.jpg
Szkło najwyższej jakości, PlanApochromaty z korekcją na szkiełka nakrywkowe i multi-immersją.
AxioObserver7LSM880AiryScanLens.jpg
Całość jest w pełni zmotoryzowana. Stolik, ostrość, kondensor, obiektywy, fluorescencja. Mikroskop działa w trzech trybach konfokalnym, super-rozdzielczym i super-rozdzielczym szybkim. Tryb konfokalny działa poprzez skanowanie skupioną wiązką lasera i zastosowanie przysłony otworkowej. Tryb super rozdzielczy osiąga poprzez zastąpienie przysłony otworkowej zmodyfikowaną soczewką fly-eye i algorytmowi kolokalizującemu sygnał z PMT z poszczególnymi soczewkami o rozmiarze 0,2 AU (vs 1AU w konfokalnym). Operacja jest bardzo prosta, wystarczy ustawić ostrość, kliknąć, resztę zrobi program ZEN i wnętrze komórki na 100x zaczyna wyglądać jak glony nitkowate na 10x
AxioObserver7LSM880AiryScanImage.jpg
- Mikroskop odwrócony, zmotoryzowany Axio Observer 7 z fluorescencją i DIC.
AxioObserver7mot.jpg
Optyka najwyższej klasy, PA.
AxioObserver7motLens.jpg
Niby nic specjalnego, ale jednak.
Te mikroskopy mają założone standardowe kamery 1 w związku z czym oferują znacznie mniejsze pole widzenia niż lustrzanka. Jednak dzięki motoryzacji, można odejść 5 metrów od mikroskopu (zero drgań), ustalić ostrość na małym przenośnym monitorku (lub skorzystać z autofocusa! naprawdę niezły) i kliknąć go". Wtedy mikroskop zaczyna robić błyskawiczne z-stacki i panoramuje cały preparat. Całość jest naprawdę błyskawiczna. Powiedzmy, że ustawiając obiektyw 20x i wybierając z-stack, mikroskop stworzy panoramę z FOV jak przy 5x w ciągu może 2 minut. dla fluorescencji. Mikroskop posiada autofocus, follow focus (jak raz złapie, to już nie puści), automatyczne zbieranie fluorescencji z wielu kanałów, time-lapse i wiele innych. Czysta przyjemność z pracy, może kiedyś.
Jednak dla ruchliwego planktonu, lustrzanka z lampą błyskową wciąż jest nie do pobicia. A cena sprzętu jest. spora.
AxioObserver7motImage.jpg
- Mikroskop odwrócony z pełną automatyką CellDiscoverer 7
CellDiscoverer7.jpg
To urządzenie akurat mnie zbytnio nie zainteresowało, jednak posiada kilka ciekawych funkcji. Automatycznie wykrywa preparat, ustawia ostrość i wykonuje żądane zdjęcia w żądanym czasie i miejscach (np: 1 dziennie przez miesiąc na 2 preparatach). Największą ciekawostką jest automatyczna immersja. Mikroskop sam zwilża preparat, następnie odpompowuje ciecz. Taki postaw i zapomnij". Nie przypomina mikroskopu w najmniejszym stopniu, choć w środku, jest wszystko co trzeba. Pomimo, że pozostałych, również praktycznie się nie dotyka, tu jednak pozostaje takie dziwne uczucie, że coś jest nie tak.

- Mikroskop stereoskopowy z fluorescencją Axio Zoom V16 i modułem ala konfokalnym ApoTome2.
AxioZoomV16.jpg
Rozdzielczość 0.3 mikrometra, powiększenie 2x-25x (aka 20x-250x). Przełącznik stereo-mono. Fluorescencja, pełna automatyka. Automatyka, jak się przekonałem, to świetna sprawa, choć akurat ten model, miał jej nieco zbyt wiele. Przy każdym cyklu fotograficznym, chował lustro światła przechodzącego, co wydłużało czas 50 fotograficznego Z-stacka z paru sekund do 5 minut. W efekcie, stacki we fluorescencji były znacznie szybsze.
JohnyM

Re: Spotkanie Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych - Relacja V2

Post autor: JohnyM »

Mikroskop ten, jest ciekawy właśnie ze względu na fluorescencję. Posiada obiektywy APO lub Fluor (ten akurat wyposażony we fluory), o stosunkowo dużej NA (mniej-więcej zastępuje mikroskop biologiczny do 20x).
AxioZoomV16lens.jpg
Bardzo ciekawym urządzeniem jest wstawka ApoTome2. Składa się ona ze zmotoryzowanej siatki dyfrakcyjnej, która jest rzucana w polu widzenia mikroskopu (działa jak przysłona polowa, która kroi preparat na prążki) i jest błyskawicznie przemieszczana od prawej do lewej. Efekt jest zbliżony do mikroskopu konfokalnego, jednak w tej technice nie ma limitu dolnego powiększenia i pozwala to bardzo ograniczyć rozproszone światło fluorescencyjne bez potrzeby skanowania preparatu.



Sprzęt bardzo ciekawy, mnóstwo wiedzy. Odnośnie organizacji technicznej: nocleg w akademiku, w zależności od standardu 50-100zł za dobę. Cały czas dostępne soki, woda z cytryną i miętą, kawa, herbata, różne ciasta.
Obs_1.jpg
Obiad i śniadanie w formie szwedzkiego stołu, wysoka jakość żywności.
Każdy z uczestników otrzymał pamiątkowy zestaw. Siatka, notatnik, długopis, podkłada pod mysz, broszurka propagandowa i publikacja o automatyce w mikroskopii. Miły gest.
Obs.jpg
Koszt ZERO złotych. Co prawda mikroskopów jest tylko 5 i nie tak wysokiej klasy jak w sezonowej szkole", również nie ma zniżki na zakupy, jednak nie jest to koszt 1000zł za wiedzę ze szkoły średniej. Da się?
AxioZoomV16image.jpg
JohnyM

Re: Spotkanie Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych - Relacja V2

Post autor: JohnyM »

Dzień 2, to głównie wykłady. Prezentacja specjalistycznych zastosowań, napotykane problemy i stosowane rozwiązania w danych dziedzinach badawczych. Nie będę się rozpisywał, chyba ze kogoś coś interesuje?
program.jpg
Dodatkowo były 3 prezentacje od Zeissa, z prostych ciekawostek technicznych, które mogą nas zainteresować:
-Opracowali NOWE obiektywy (dla CellDiscoverer, może także dla innych), które potrzebują do działania optovara aka magnification changera. Czyli NIE DAJĄ pustego powiększenia, a zmiana w optovarze, zmienia także NA obiektywu. Jak to wytłumaczyli, obiektyw nie ma kilku szkiełek w środku, a te które ma są zamontowane na mikrometrze i dostosowują się do wybranego powiększenia. Dostępne są 0,5x 1x 1,5x i przykładowo z obiektywem 20x (nie robiłem notatek, piszę z pamięci więc coś mogłem pomieszać ale pamiętam że NA było na poziomie standardowych PA) daje to:10x/0.5 20x/0.8 30x /0.95 .

-Zautomatyzowana immersja i suszenie preparatu. Nie mogę powiedzieć, że widziałem na żywo, bo mikroskop to taka szczelnie zamknięta, biała skrzynka. Ale przejście z suchej 40x na wodną 60x i z powrotem na suchą 40x zajmuje parę sekund. Łatwo o tym zapomnieć i nagle obiektywy immersyjne przestają być irytujące .
Całość jest sterowana takim urządzeniem:
MotorizedControler.jpg
Ekran dotykowy pozwala szybko i przyjemnie przełączać się pomiędzy obiektywami / technikami kontrastowania. Śruba mikro i makrometryczna działa momentalnie (układ jest na kablu) i trudno się zorientować, że to nie jest śruba w mikroskopie.

-Odnośnie mikroskopii korelatywnej, puentą było to, że z dzisiejszą techniką możliwe jest zobrazowanie tej samej próbki np: we fluorescencji, potem przełożyć ją do eSEM gdzie system automatycznie odnajdzie to co oglądaliśmy we fluo, potem można z powrotem przełożyć to np.: na DIC i porównać 3 te same obrazy z różnych mikro i z różną informacją. Nawet można to zautomatyzować, tak, że robot przekłada próbkę.

-Mikroskopia X-Ray rentgenowska. To jest bardzo ciekawe. Właściwie nie ma ŻADNYCH ograniczeń poza kosztem, dużym rozmiarem, i wolnym czasem pracy (do pierwotniaków się nie nada). Rozdzielczość jak w SEM, pole widzenia jak w stereoskopie, widzi PRZEZ preparat (nie trzeba ciąć na mikrotomie), ma kontrast fazowy (widzi praktycznie wszystko).
Czego nie potrafi (na razie): zrobić zdjęcia czegoś ruchliwego, manipulować specyficznym kontrastem jak mikro fluorescencyjny i konfokalny (działa na zasadzie kontrastu materiałowego).

-Szybka, super-rozdzielcza mikroskopia konfokalna. Tu będę miał trochę fotek do pokazania, ale na to trzeba poczekać (format CZI, duże pliki, informacja jest na wszystkich płaszczyznach czyli do stacka [jak my to rozumiemy - 1 fotki] się nie nadaje, każdy hyperstack ma 2-3 kanały).
Zeiss wymyślił prosty, stosunkowo tani sposób na mikroskopię super-rozdzielczą, nazwali to AiryScan. Zmodyfikowali detektor PMT i wstawili przed niego coś w stylu soczewki Fly eye". W standardowym mikroskopie konfokalnym, światło rozproszone jest wycinane przez przysłonę otworkową, zazwyczaj o rozmiarze 1 AU - im bardziej go przymykamy, tym bardziej rośnie rozdzielczość, ale także wzrasta SNR. Jedna soczewka w Airyscanie ma rozmiar 0,2 AU - czyli 5x mniejszy niż optymalny dla normalnego konfokala, ale jest ich dużo i w efekcie SNR jest na poziomie 1 - 2 AU.
Efekt jest taki, że jest super-rozdzielczość z szybkością normalnego konfokala, lub szybciej, gdy poświęci się nieco rozdzielczości (wtedy jest szybszy niż konfokal i wciąż lepsza rozdzielczość). Dodatkowo system jest mniejszy, bardziej uniwersalny (działa na wszystkich laserach, bez potrzeby interferencji między wiązkami), i znacznie prostszy od innych technik (np.: zobaczcie sobie system 4pi lub IPALM").
JohnyM

Re: Spotkanie Użytkowników Mikroskopów Konfokalnych - Relacja V2

Post autor: JohnyM »

Dzień 3, dużo zdjęć. Myślę, że mikroskop super-rozdzielczy ma duży potencjał artystyczny, jeśli ktoś ma parę milionów euro na zbyciu, to z ręką na sercu polecam

Mała próbka na szybko. Te co prawda nie były wykonywane w celach artystycznych, ale widać jaki jest potencjał.
Format CZI jest obsługiwany przez ZEN (częściowo darmowy) i ImageJ (darmowy, choć toporny jak tępa siekiera przy cięciu betonowych bloków).
Chloroplasty i miozyna na konfokalu. FOV 40x40 mikrometrów, rozdzielczość 300 nm
Screenshot.jpg
Chloroplasty autofluorescencja na super-rozdzielczym:
Clipboard.jpg
Zbliżenie na układ 3d w komórce:
Volume_Viewer_1.jpg
Teraz super rozdzielczość. tylakoidy w 3d :
Volume_Viewer_2.jpg
Świetna rzecz. do każdego stosu jest dołączona metadata aka EXIF z WSZELAKĄ informacją o parametrach. Mikroskop, przystawka konfokalna, obiektyw, na, przystawka super-rozdzielcza, długość fali laserów, moc laserów, położenie stolika, śruba mikrometryczna, temperatura próbki. o czym kolwiek jesteś w stanie pomyśleć. ta informacja jest zapisana. Z wyjątkiem tego, jaką kawę/herbatę pił użytkownik w czasie rejestrowania obrazów
Clipboard-1.jpg
Nawet nie trzeba tego czytać, wystarczy kliknąć pobierz metadane i potem odwzoruj parametry - mikroskop sam się ustawi tak jak było to zrobione X lat temu.
ODPOWIEDZ
  • Podobne tematy
    Odpowiedzi
    Odsłony
    Ostatni post

Kto jest online

Użytkownicy przeglądający to forum: Obecnie na forum nie ma żadnego zarejestrowanego użytkownika i 0 gości